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細(xì)胞培養(yǎng)知識(shí)(一)

發(fā)布日期: 2013-08-27
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冷凍管應(yīng)如何解凍? 
取出冷凍管后, 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍, 輕搖冷凍管使其在分鐘內(nèi)全部融化, 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿, 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí), 必須注意安全, 預(yù)防冷凍管之爆裂。 

細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí), 是否應(yīng)馬上去除DMSO 
除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO 敏感之細(xì)胞外, 絕大部分細(xì)胞株(包括懸浮性細(xì)胞), 在解凍之后, 應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中, 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可, 如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題。 

可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基? 
不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基, 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基, 細(xì)胞大都無法立即適應(yīng), 造成細(xì)胞無法存活。 

可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類? 
不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營養(yǎng)來源, 所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清, 在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同,血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無法存活。 

何謂FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) FCS (fetal calf serum) 是相同的意思, 兩者都是指胎牛血清, FCS 乃錯(cuò)誤的使用字眼, 請(qǐng)不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。
 
培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5 % 10% CO2?或根本沒有影響? 
一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng), 而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時(shí),細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10 % CO2;當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時(shí), 則應(yīng)使用5 % CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。

何時(shí)須更換培養(yǎng)基? 
視細(xì)胞生長密度而定, 或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間,按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。
 
培養(yǎng)基中是否須添加抗生素? 
除于特殊篩選系統(tǒng)中外, 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下, 培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。
 
附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用之trypsin-EDTA 濃度?應(yīng)如何處理? 一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。*次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中, 保存于-20 °C,避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 之活性降低, 并可減少污染之機(jī)會(huì)。 

10 
懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理? 
一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中, 稀釋細(xì)胞濃度即可, 若培養(yǎng)液太多時(shí), 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高, 直到無法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶, 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度, 重復(fù)前述步驟即可。 

11 
欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來,其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速?
欲回收動(dòng)物細(xì)胞, 其離心速率一般為300xg (1,000rpm),5 - 10 分鐘, 過高之轉(zhuǎn)速, 將造成細(xì)胞死亡。 

12 
細(xì)胞之接種密度為何? 
依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長之一重要原因。 

13 
細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何? 
動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 90 - 95 % 原來細(xì)胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意:由于DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能, 故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中, 必須使用前先行配制完成。 

14 DMSO 
之等級(jí)和無菌過濾之方式為何? 
冷凍保存使用之DMSO 等級(jí), 必須為Tissue culture gradeDMSO (Sigma D2650), 其本身即為無菌狀況, *次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中, 保存于4°C, 避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì), 并可減少污染之機(jī)會(huì)。若要過濾DMSO, 則須使用耐DMSO Nylon 材質(zhì)濾膜。 

15 
冷凍保存細(xì)胞之方法? 
冷凍保存方法一冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘 (-20 °C30 分鐘*)  -80 °C 16~18 小時(shí)或隔夜)  液氮槽vaporphase 長期儲(chǔ)存。 冷凍保存方法二冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 °C -80 °C 以下, 再放入液氮槽vapor phase長期儲(chǔ)存。*-20 °C 不可超過小時(shí), 以防止冰晶過大,造成細(xì)胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微 降低一些。 

16 
細(xì)胞欲冷凍保存時(shí), 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度?
 
冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial, 融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。 

17 
應(yīng)如何避免細(xì)胞污染? 
細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之方法。 

18 
如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí),應(yīng)如何處理? 
直接滅菌后丟棄之。 

19 
支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞, 是否能以肉眼觀察出異狀? 
不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外,大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株, 無法以其外觀分辨之。 

20 
支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響? 
支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長參數(shù), 代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前,必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free,實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。 

21 
偵測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí), 該如何處理?直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細(xì)胞株。 

22 CO2 
培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔? 
定期至少每?jī)芍芤淮?/span>) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。 

23 
為何培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中, 顏色會(huì)偏暗紅色, pH值會(huì)越來越偏堿性? 
培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中, 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會(huì)逐漸溢出,造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑通常為phenol red) 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果, 將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí), 可以通入無菌過濾之CO2, 以調(diào)整pH 值。 

24 
各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish,flask是否均相同? 
不同廠牌的dish flask, 其所coating polymer 不同, 制造程序亦不同, 雖對(duì)大部分細(xì)胞沒有太大之影響, 惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish flask 而有顯著之生長差異。 

25 
購買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后,為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形? 
研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少, 大都是因?yàn)殡x心過程操作上的失誤, 造成細(xì)胞的物理性損傷, 以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心, 應(yīng)待細(xì)胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。 

26 
購買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因? 
研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳, 常見原因可歸納為:培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后, 加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于-80 °C 太久。 

27 
收到之冷凍管瓶身破裂,瓶蓋有裂紋,或瓶蓋脫落之原因? 
冷凍管瓶蓋裂紋,或瓶身破裂,可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng),造成冷凍管裂損,建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫,乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象,冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染,故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí),均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。

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