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hot news無菌操作基本技術(shù)
1. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前,無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌,以70% ethanol 擦拭無菌操作抬面,并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后,才開始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株,且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基,以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后,將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺,以70% ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘以上后,再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。
2. 無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞,必要物品,例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置,其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出,以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70% ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域,勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。
3. 小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品,避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口,亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后,以手夾住瓶蓋并握住瓶身,傾斜約45°角取用,盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應(yīng)注意自身之安全,須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對于來自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作,并選擇適當(dāng)?shù)燃壷疅o菌操作臺(至少Class II)。操作過程中,應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生,小心毒性藥品,例如DMSO 及TPA 等,并避免尖銳針頭之傷害等。
5. 定期檢測下列項(xiàng)目: 5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力 5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水,每周更換)。 5.3. 無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力,定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜,預(yù)濾網(wǎng)(300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng),3000 小時(shí)/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750),定期更換水槽的水。
實(shí)驗(yàn)用品
1. 種類?
1.1. 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品均為無菌,除了玻璃容器與pasteur pipet 外,其它均為塑料無菌制品。
1.2. TC 級培養(yǎng)盤表面均有coating 高分子物質(zhì)以讓細(xì)胞吸附,培養(yǎng)容器種類有Tflask,plates, dishes, roller bottle 等,依實(shí)驗(yàn)需要使用。
1.3. plastic sterile pipet: 1ml, 2ml,5ml, 10ml, 25ml
1.4. 塑料離心管: 15ml, 50ml,均有2 種不同材質(zhì),其中polypropylene (PP) 為不透明材質(zhì),polystyrene (PS) 為透明材質(zhì),可依實(shí)驗(yàn)需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。
1.5. glass pastuer pipet: 9 inch,用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。
1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware):100ml, 250ml,500ml,1000ml
2. 清洗? 2.1. 新購玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數(shù)小時(shí),洗凈后才開始使用。 2.2. 用過之玻璃血清瓶,以高壓蒸汽滅菌,洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈,勿加清潔劑清洗。
3. 滅菌?
3.1. 實(shí)驗(yàn)用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋,高壓蒸汽滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘,置于oven 中烘干。
3.2. 實(shí)驗(yàn)用玻璃pasteur pipet 以干熱滅菌170℃, 4 小時(shí)。
3.3. 液體或是固體廢棄物可用10% hypochloride 溶液(次氯酸,即漂白水) 或是蒸汽高壓滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘處理。
培養(yǎng)基
1. 液體培養(yǎng)基貯存于4℃冰箱,避免光照,實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前放在37℃水槽中溫?zé)帷?
2. 液體培養(yǎng)基(加血清) 存放期為六個(gè)月,期間glutamine 可能會(huì)分解,若細(xì)胞生長不佳,可以再添加適量glutamine。
3. 粉末培養(yǎng)基配制(以1 升為例):
3.1. 細(xì)胞培養(yǎng)基通常須添加10% 血清,因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900ml,pH 為7.2 - 7.4。NaHCO3 為另外添加,若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會(huì)造成pH 之誤差,或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3 粉末應(yīng)分別溶解后才混合,然后用CO2 氣體調(diào)整pH,而非用強(qiáng)酸(HCl)或強(qiáng)堿(NaOH),因?yàn)槁入x子對細(xì)胞生長可能有影響,且貯存時(shí)培養(yǎng)基的pH 易發(fā)生改變。 3.2. 材料:
3.2.1. 純水(milli-Q 水或二次至三次蒸餾水,水品質(zhì)非常重要)
3.2.2. 粉末培養(yǎng)基
3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019)
3.2.4. 電磁攪拌器
3.2.5. 無菌血清瓶
3.2.6. 0.1 或0.2 mm無菌過濾膜
3.2.7. pH meter
3.2.8. 真空幫浦
3.2.9. CO2 氣體
3.3. 步驟:
3.3.1. 取粉末培養(yǎng)基溶于700ml milli-Q 水中,攪拌使其溶解。
3.3.2. 稱取適量之NaHCO3 粉末(數(shù)量依培養(yǎng)基種類而異,表一)溶于200ml milli-Q 水中,攪拌使其溶解,然后通入CO2 氣體至飽和,約3-5 分鐘。
3.3.3. 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合。混后溶液之pH應(yīng)為7.2-7.4,除非pH 值偏差太大,否則不需用酸堿再調(diào)整之。若為太堿,可再通入CO2 氣體調(diào)整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過過濾膜時(shí),pH 會(huì)升高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌,同時(shí)分裝至無菌容器中,標(biāo)示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號等,貯存于4℃。(血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過濾)
3.3.5. 配制之培養(yǎng)基配制須作生長試驗(yàn)與污染測試。
4. 配制培養(yǎng)基之生長測試
4.1. 材料:
4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish)
4.1.3. methanol
4.1.4. glacial acetic acid
4.1.5. 10% Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)
4.2. 步驟:
4.2.1. 以待測試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK cell,接種MDCK 細(xì)胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中,每個(gè)well 接種1 × 102 活細(xì)胞,同時(shí)作對照組實(shí)驗(yàn)。
4.2.2. 接種5~7 天后,在100 倍倒立顯微鏡作觀察細(xì)胞群落之生長,待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察,而群落間不互相接觸時(shí)即可。 4.2.3. 去除培養(yǎng)基,加入1ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸? 3:1),室溫下靜置10 min。
4.2.4. 去除固定液,水洗二次。
4.2.5. 加入1ml 10% Giemsa solution,,室溫下靜置染色2-3 min。
4.2.6. 去除染液,水洗二次。
4.2.7. 以肉眼計(jì)數(shù)群落數(shù),并比較之,若新配制或新批號的培養(yǎng)基對細(xì)胞生長不佳,則丟棄之。