細(xì)胞培養(yǎng)的條件一般離不開這5個(gè):合適的細(xì)胞培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)血清、無菌無毒細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境、恒定的細(xì)胞生長溫度、合適的氣體環(huán)境
絕大部分細(xì)胞消化的時(shí)候是只要用胰酶潤洗一遍即可。吸去胰酶后,殘留的那些無法計(jì)算體積的附著在細(xì)胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足夠消化細(xì)胞(絕大部分1min不到)。對(duì)于這些細(xì)胞原則上不要用胰酶孵育細(xì)胞,連續(xù)這樣傳代,對(duì)細(xì)胞傷害很大。
不是細(xì)胞全部成間隔分布很離散的單個(gè)圓形才算消化好了,一般你肉眼觀察貼壁細(xì)胞層,只要能移動(dòng)了,多半呈沙壯移動(dòng),其實(shí)已經(jīng)可以了,很多人喜歡把細(xì)胞消化或者吹打成*分離細(xì)胞,這是沒有必要的。一般能移動(dòng)了,說明細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)材料的附著已經(jīng)消失了,細(xì)胞之間的附著也已經(jīng)消失了,細(xì)胞已經(jīng)獨(dú)立分布了(雖然沒有呈現(xiàn)很廣的離散分布)。這個(gè)時(shí)候應(yīng)該停止消化,不要等到看到鏡下所有細(xì)胞都分離得非常好,間隙很大,才停止。
細(xì)胞就是*成單個(gè)細(xì)胞懸液,之后在貼壁的過程中仍然會(huì)聚集,這個(gè)是貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞,尤其是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)特性,無論死活的細(xì)胞都是如此,你可以嘗試,準(zhǔn)備100%的單個(gè)細(xì)胞懸液,貼壁后觀察細(xì)胞,仍然是幾個(gè)幾個(gè)細(xì)胞聚集在一起。一些懸浮培養(yǎng)細(xì)胞也是如此,容易聚集,不要去嘗試過幾個(gè)小時(shí)就拿出來吹打成單細(xì)胞懸液(不要笑,這個(gè)是初養(yǎng)懸浮細(xì)胞的人常犯的錯(cuò)誤,以為懸浮培養(yǎng)就是一個(gè)一個(gè)分開)。細(xì)胞只要能從基質(zhì)上脫離下來,這個(gè)時(shí)候即使是成片的(比如Calu-3細(xì)胞),吹打不超過20次后(一般10次即可),成小規(guī)模聚集(10個(gè)細(xì)胞左右),是正常的,不要試圖再去延長消化時(shí)間,或者象有的同學(xué)那樣吹打1h,等待單細(xì)胞懸液出現(xiàn)。
比較難消化的細(xì)胞(潤洗方法5min還不能消化),就以coloncancer為例,比如HCT15,LS411和KM12,這樣的細(xì)胞一般需要用少量胰酶孵育,但也不需要很多,一般100mmdish,一次多加入500ul,就足夠了,一般我加300ul。即使這樣難消化的細(xì)胞,一般不超過5min,即可見細(xì)胞成片移動(dòng),就應(yīng)該停止消化。一些正常細(xì)胞也會(huì)有難消化的時(shí)候,比如tsDC細(xì)胞,但也只要用少量胰酶孵育,3min左右即可看到成片沙狀移動(dòng)。