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細胞培養(yǎng)知識(四)

發(fā)布日期: 2013-08-27
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1.如何選用培養(yǎng)基?
   培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之,MEM做粘附細胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細胞培養(yǎng),各種目的無血清培養(yǎng)的是AIM V培養(yǎng)基(SFM)。
 
2.為什么要熱滅活血清?
   加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細胞事件,刺激平滑肌收縮,細胞和血小板釋放組胺,激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時,推薦使用熱滅活血清。

3.L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎?
   它在溶液中不穩(wěn)定嗎? L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解,但是確切的降解率一直沒有zui終確定。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成,而氨對于一些細胞具有毒性。

4.GlutaMAX-I是什么?
   培養(yǎng)細胞如何利用GlutaMAX-I?這個二肽有多穩(wěn)定? GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物,將其不穩(wěn)定的α-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定,即使在121磅滅菌20分鐘,GlutaMAX-I二肽溶液有zui小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎*降解。

5.為什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅?
   酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用(特別是雌激素)。為避免固醇類反應(yīng),培養(yǎng)細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

6.如何用臺盼蘭計數(shù)活細胞?
   用無血清培養(yǎng)基把細胞懸液稀釋到200-2000個/毫升,在0.1毫升的細胞中加入0.1毫升的0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻,數(shù)分鐘后,用血球計數(shù)板計數(shù)細胞?;罴毎懦馀_盼蘭,因而染成藍色的細胞是死細胞。

7.如何消除組織培養(yǎng)的污染?
   當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時,研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母,把污染細胞與其它細胞系隔離開,用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺,檢查HEPA過濾器。高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性,因而,做劑量反應(yīng)實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。
  1)在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細胞,稀釋到常規(guī)細胞傳代的濃度。
  2)分散細胞懸液到多孔培養(yǎng)板中,或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內(nèi),把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如,兩性霉素B推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。
  3)每天觀測細胞毒性指標,如脫落,出現(xiàn)空泡,匯合度下降和變圓。
  4)確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度2-3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞2-3代。
  5)在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一代。
  6)重復(fù)步驟4。
  7)在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6代,確定污染是否以已被消除。

8.培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么?
   丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源。盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

9.Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么?
   Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)和Earle’s平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別? HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,碳酸氫鈉的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中,溶液會變堿,Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織,需要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細胞培養(yǎng)基中儲存的組織,用Hanks液就可以了。

10.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差別?
   Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執(zhí)行的所有的標準檢驗程序,而且除了這些標準檢測,Certified胎牛血清還有如下一些附加的檢測:End-Point Determination of Endotoxin Content噬菌體檢驗生物化學(xué)檢測 激素的檢測血紅蛋白檢測Sf9 細胞生長促進及方法學(xué)檢測

11.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么?
   二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前,用EDTA清洗細胞,以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。

12.制備 lipid-DNA的方法會影響轉(zhuǎn)染效率嗎?
   是的。對于LIPOFECTAMlNE Reagent,稀釋試劑在100μl OPTI-MEM中,稀釋DNA在100μl OPTI-MEM中?;旌蟽煞N溶液在室溫下孵育15分鐘。對于LIPOFECTIN Reagent,在加入DNA溶液前允許稀釋的試劑和培養(yǎng)基孵育至少30分鐘可以增加3倍的效率。確保復(fù)合物在沒有血清的情況下形成。孵育15分鐘后,在復(fù)合物中加入含有血清的培養(yǎng)基(800μl)。(注意以上是35mm培養(yǎng)皿使用體積)。對于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA應(yīng)該在與脂質(zhì)體混合之前首先與Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步驟允許在一個很小的體積下混合DNA和脂質(zhì)體,接下來可以不需要換培養(yǎng)基的情況下直接加入。

13.我使用SF900 Ⅱ時,細胞生長良好,但是為什么我的蛋白產(chǎn)物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時效果好?
   如果目的蛋白是一個后期蛋白,它將與蛋白酶一起表達,這些蛋白酶將會作用于目的蛋白。在加有血清的培養(yǎng)基中,這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白,從而使目的蛋白產(chǎn)品保持完好。在無血清配方中,蛋白酶作用的*底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題,加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清(少于1%),讓血清給蛋白酶提供作用底物。

14.如何檢測內(nèi)毒素(熱源)水平?
   LAL(Limulus Amebocyte Lysate)試驗是可用的zui敏感和特異的檢測細菌內(nèi)毒素的方法。Levin和Bang 發(fā)現(xiàn)細菌可引起鱟(Limulus polyphemus)血管內(nèi)的凝集作用。內(nèi)毒素啟動一個細胞內(nèi)酶原系統(tǒng)(絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)),通過修飾凝集素,產(chǎn)生一種透明的膠,LAL中的凝固蛋白,從而,形成不可溶的基質(zhì)。LAL試劑緩沖的鱟(血細胞)裂解物。胎牛血清的內(nèi)毒素檢測是在Grand Island,按照手冊上Gel-clot 方法進行的。在對血清產(chǎn)品進行內(nèi)毒素檢測前,用無熱源的水1:10稀釋樣品。稀釋樣品沸水育5分鐘,以消除抑制劑。(通常,血液中的內(nèi)毒素結(jié)合成份的出現(xiàn)會抑制凝膠過程,使內(nèi)毒素不能與LAL反應(yīng)。樣品預(yù)先熱處理可以消除這種抑制作用。)

 15.我可以使用固體形式的Murashige Skog 培養(yǎng)基嗎?
   如果使用固體形式的培養(yǎng)基,需要加入瓊脂。瓊脂加入前要先滅菌。應(yīng)該避免MS培養(yǎng)基的直接滅菌,應(yīng)該高壓滅菌瓊脂溶液,然后把融化的瓊脂溶液加入到MS培養(yǎng)基中。

16. 20℃下配制的緩沖液,在較高或較低的溫度下PH值會改變嗎?
   對于普通使用的緩沖液,PH值隨溫度變化而變化。下表列出溫度改變10℃時,PH值的變化情況例如 20℃下配制PH7.4 Tris緩沖液,40℃時PH值為 7.4-(2x0.310)=6.7817. 室溫下(25℃)配制的

17.Tris-HCl溶液,在37℃使用時PH值是多少?
   緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃,25℃,37℃時,不同的PH值。

18. 昆蟲細胞培養(yǎng)的zui適PH值和滲透壓是多少?
   生長培養(yǎng)基的PH值對細胞的增值和病毒或重組蛋白的生產(chǎn)均會產(chǎn)生影響。對于大部分鱗翅類昆蟲細胞系,在PH值 6.0-6.4范圍的大部分應(yīng)用效果良好。培養(yǎng)鱗翅類昆蟲細胞系時,培養(yǎng)基的zui適滲透壓是 345-380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細胞培養(yǎng)方式,減少技術(shù)問題,保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內(nèi)。

19. High Five細胞有任何其它名稱嗎?
   High Five細胞也被稱為Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。

20.在High Five無血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度是多少?
   High Five無血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度:0.025 g/L Tween-80,1.0 g/L Pluronic Poly-all。

21.High Five細胞用多大的密度凍存?
   3.0x10E6 cells/ml

22.在我的果蠅培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)形成白色沉淀,加熱后溶解。它是什么?對我的細胞有害嗎?
   可能是谷氨酰胺沉淀,但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培養(yǎng)基中谷氨酰胺的濃度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的濃度比在RPMI 1640中高25倍,而且比谷氨酰胺更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復(fù)合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養(yǎng)條件下可以溶解,對實驗不會有不利的影響。

23.如何從T25瓶中轉(zhuǎn)移sf9細胞?能用胰蛋白酶消化嗎?
   我們強力推薦使用脫落細胞的方法,因為這項技術(shù)破壞性zui小,生活力zui高。通過使用巴氏德吸液管,讓細胞上培養(yǎng)基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。只有在必要的情況下,才使用胰酶消化細胞。胰酶消化一個T25瓶的sf9細胞:1)去除培養(yǎng)基。2) 用2ml 1xPBS(足以覆蓋細胞表面)洗滌細胞,去除PBS.3) 加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好覆蓋細胞表面)。4) 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。5) 向細胞中加入2ml 細胞培養(yǎng)液,移入錐形管,用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁,移入同一錐形管中。(培養(yǎng)基中的FBS終止了胰酶的活性。)6) 離心(1100rpm)沉淀細胞。去除培養(yǎng)基。7) 用新的培養(yǎng)基重新懸浮細胞。傳代。 24.在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養(yǎng)時,肝素的使用量是多少? 為了防止懸浮培養(yǎng)細胞聚集的形成,使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。 25.如何評估ES細胞合格的胎牛血清? 使用D3 ES細胞。這是一個對于胎牛血清中生長促進、生長抑制和分化因子非常敏感的細胞系。相關(guān)生長效率分析:當(dāng)ES細胞以非常低的密度傳入包含10%胎牛血清的生長培養(yǎng)基中,檢測開始和支持ES細胞克隆的能力。細胞毒分析:當(dāng)以非常低的密度傳入包含30%胎牛血清的生長培養(yǎng)基中,檢測ES細胞和feeder細胞的生長能力。相關(guān)形態(tài)學(xué)和分化分析:檢測胎牛血清支持未分化ES細胞克隆的能力。通過堿性磷酸酶活性評估分化程度。未分化的ES細胞小顏色深紅粉紅,分化的細胞較大,豐滿,顏色較淺。所有的分析在沒有ESGRO的情況下進行的,培養(yǎng)基中出現(xiàn)ESGRO會掩蓋由胎牛血清所導(dǎo)致的問題。(ESGRO或LIF經(jīng)常用來保持ES細胞處于未分化狀態(tài)。)經(jīng)過培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),大約8批中有1批可以用來培養(yǎng)ES細胞。

26.在重新凍存sf9細胞前,它可以傳多少代?隨著傳代的次數(shù)的增加,它的感染能力會降低嗎?
   通常情況當(dāng)細胞經(jīng)過30次傳代后,應(yīng)該返回凍存。無論什么時候記數(shù)時,都應(yīng)該檢查細胞活力。如果超過95%的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍,細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降,它們的感染力將不在是有效的。
 

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