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hot news要素一、無菌實驗技術
1. 實驗進行前,無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60分鐘滅菌,以70% ethanol擦拭無菌操作臺面,并開啟無菌操作臺風扇運轉10分鐘后,才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株,且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基,以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后,將實驗物品帶出工作臺,以70% ethanol擦拭無菌操作臺面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10分鐘以上后,再進行下一個細胞株的操作。
2.無菌操作工作區(qū)域應保持清潔及寬敞,必要物品,例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置,其它實驗用品用完即應移出,以利于氣流流通。實驗用品以75% ethanol擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應在臺面的中央無菌區(qū)域,勿在邊緣非無菌區(qū)域操作。
3.小心取用無菌的實驗物品,避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口,亦不要在打開的容器正上方操作實驗。容器打開后,以手夾住瓶蓋并握住瓶身,傾斜約45°角取用,盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4.工作人員應注意自身安全,須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作,并選擇適當?shù)燃壍臒o菌操作臺(至少Class II)。操作過程中,應避免引起aerosol的產(chǎn)生,小心毒性藥品,例如DMSO 及TPA 等,并避免尖銳針頭的傷害等。
5. 定期檢測下列項目
5.1. CO2 鋼瓶的CO2 壓力。
5.2. CO2 培養(yǎng)箱的CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水,每周更換)。
5.3. 無菌操作臺內(nèi)的airflow 壓力,定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜,預濾網(wǎng)(300小時/預濾網(wǎng),3000 小時/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750),定期更換水槽的水。
要素二、實驗用品
1. 種類
1.1. 細胞培養(yǎng)實驗用品均為無菌,除了玻璃容器與pasteur pipet 外,其它均為塑料無菌制品。
1.2. TC 級培養(yǎng)盤表面均有coating 高分子物質以讓細胞吸附,培養(yǎng)容器種類有Tflask,plates, dishes, roller bottle 等,依實驗需要使用。
1.3. plastic sterile pipet: 1ml, 2ml,5ml, 10ml, 25ml
1.4. 塑料離心管: 15ml, 50ml,均有2種不同材質,其中polypropylene (PP) 為不透明材質,polystyrene (PS) 為透明材質,可依實驗需要而選擇適合材質的離心管。
1.5. glass pastuer pipet: 9 inch,用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。
1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware):100ml, 250ml,500ml,1000ml
2. 清洗
2.1. 新購玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數(shù)小時,洗凈后才開始使用。
2.2. 用過的玻璃血清瓶,以高壓蒸汽滅菌,洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈,勿加清潔劑清洗。
3. 滅菌
3.1. 實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋,高壓蒸汽滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘,置于oven 中烘干。
3.2. 實驗用玻璃pasteur pipet 以干熱滅菌170℃, 4 小時。
3.3. 液體或是固體廢棄物可用10% hypochloride 溶液(次氯酸,即漂白水) 或是蒸汽高壓滅菌121℃,15 lb,20 分鐘處理。
要素三、培養(yǎng)基
1. 液體培養(yǎng)基貯存于4℃冰箱,避免光照,實驗進行前放在37℃水槽中溫熱。
2. 液體培養(yǎng)基(加血清) 存放期為六個月,期間glutamine 可能會分解,若細胞生長不佳,可以再添加適量glutamine。
3. 粉末培養(yǎng)基配制(以1 升為例):
3.1. 細胞培養(yǎng)基通常須添加10% 血清,因此粉末培養(yǎng)基的配制體積為900ml,pH 為7.2 - 7.4。NaHCO3 為另外添加,若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會造成pH的誤差,或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3 粉末應分別溶解后才混合,然后用CO2 氣體調整pH,而非用強酸(HCl)或強堿(NaOH),因為氯離子對細胞生長可能有影響,且貯存時培養(yǎng)基的pH 易發(fā)生改變。
3.2. 材料
3.2.1. 純水(milli-Q 水或二次至三次蒸餾水,水品質非常重要)
3.2.2. 粉末培養(yǎng)基
3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019)
3.2.4. 電磁攪拌器
3.2.5. 無菌血清瓶
3.2.6. 0.1 或0.2 mm無菌過濾膜
3.2.7. pH meter
3.2.8. 真空幫浦
3.2.9. CO2 氣體
3.3. 步驟
3.3.1. 取粉末培養(yǎng)基溶于700ml milli-Q 水中,攪拌使其溶解。
3.3.2. 稱取適量的NaHCO3 粉末(數(shù)量依培養(yǎng)基種類而異,表一)溶于200ml milli-Q 水中,攪拌使其溶解,然后通入CO2 氣體至飽和,約3-5 分鐘。
3.3.3. 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解的液體培養(yǎng)基中混合。混后溶液的pH應為7.2-7.4,除非pH 值偏差太大,否則不需用酸堿再調整之。若為太堿,可再通入CO2氣體調整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過過濾膜時,pH會升高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1或0.2 mm無菌過濾膜過濾滅菌,同時分裝至無菌容器中,標示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號等,貯存于4℃。(血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過濾)
3.3.5. 配制的培養(yǎng)基配制須作生長試驗與污染測試。
4. 配制培養(yǎng)基的生長測試
4.1. 材料
4.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 4.1.2. 6-well TC plate (or 35 mm TC dish)
4.1.3. methanol
4.1.4. glacial acetic acid
4.1.5. 10% Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)
4.2. 步驟
4.2.1. 以待測試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK cell,接種MDCK 細胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中,每個well 接種1 × 102 活細胞,同時作對照組實驗。
4.2.2. 接種5~7 天后,在100 倍倒立顯微鏡作觀察細胞群落的生長,待細胞群落大到可以肉眼觀察,而群落間不互相接觸時即可。
4.2.3. 去除培養(yǎng)基,加入1ml Carnoy's 固定液(甲醇:冰醋酸 3:1),室溫下靜置10 min。
4.2.4. 去除固定液,水洗二次。
4.2.5. 加入1ml 10% Giemsa solution,,室溫下靜置染色2-3 min。
4.2.6. 去除染液,水洗二次。
4.2.7. 以肉眼計數(shù)群落數(shù),并比較之,若新配制或新批號的培養(yǎng)基對細胞生長不佳,則丟棄之。